DETECÇÃO  DE  ENDOTOXINA PELO  TESTE DO 
Limulus Amoebocyte  Lysate (LAL) EM UNIDADES  DE HEMODIÁLISE
 

FERNANDO DOS SANTOS(1), ANA G. SANTOS(1), JOÃO CARLOS BIERNAT(1), MARIA ELAINE  L. SOUZA(1), ÁUREA   RAUBACH(1), ALÉXIA  AGUIRRE(1), VERA  R. ANTONIAZZI(1), KEILA  SCORSATTO(1), IVAN SEIBEL(1), SALETE S. DEMIN(2), ANE C. HICKMANN(2), FERNANDA P. OLIVEIRA(2), EWELIN V. BORBA(2), , SANDRA SIMON(2), SCHIRLE S. SANTOS(2). (*)

(*) Trabalho elaborado nas seguintes clínicas de Porto Alegre (RG): Clinirim, Prontorim Cachoeirinha, Nefrobelém, Clínica Nefrológica Guaíba, Suneva.
(1) médicos; (2) enfermeiras.

“ Aqua  torbido non lava ” – provérbio italiano

1- INTRODUÇÃO

A água usada em Hemodiálise  pode ser origem de Endotoxinas ( ou Lipopolissacarídios ) que causam várias respostas fisiológicas agudas , como febre , calafrios , cefaléia , mal-estar , mialgias , náuseas , bocejos , coagulação de dialisador  , mas também podem determinar complicações a longo prazo , como caquexia e amiloidose , além de contribuir para sub-diálise.

Existe uma boa correlação entre a concentração de Endotoxinas e bactérias no dialisato e a presença de sintomas típicos de reação pirogênica (endotoxinemia) ( 1 ). Uma concentração bacteriana acima de 2000 colonias  / ml , em geral , determina nível de Endotoxina suficiente  para gerar  sintomas clínicos ; em altas concentrações a Endotoxina  atravessa  a membrana do dialisador  que apresente mínimas rupturas  ou até mesmo membranas intactas , determinando sintomas (2).Altas concentrações de Endotoxinas  no sangue ou líquido cérebro-espinal  podem ser fatais , devido às graves complicações  que se desenvolvem ( 16 ).

Também a água utilizada no reuso de dialisadores pode ser  fonte de contaminação por Endotoxina , que por adsorção adere às paredes internas das fibras capilares, por onde circula o sangue . Assim , mesmo com o uso de substancias bactericidas  na solução de reuso , a Endotoxina pode permanecer  aderida à membrana de diálise e ser liberada para o sangue , durante a próxima sessão ( 3 ).

Mesmo em água esterilizada podem ser encontradas altas  concentrações de Endotoxinas , enquanto que uma baixa contagem de colonias bacterianas não significa ausência de Endotoxinas. As bactérias mais frequentemente encontradas em água de Hemodiálise são gram-negativas , em torno de 90 % , com franco predomínio do gênero Pseudomonas. Bactérias gram-negativas  podem se multiplicar muito rapidamente , mesmo em água esterilizada , alcançando altas concentrações ( > 100.000 col/ml ) em menos de 48 horas. Em soluções de diálise este crescimento bacteriano pode ser mais rápido , pela presença de glicose e bicarbonato , gerando altos níveis de Endotoxinas (3 , 17 ) , como se observa na figura 1.

Figura I : Multiplicação bacteriana e produção de endotoxina, em concentrado de bicarbonato, a 30 ° C.

As membranas  do tipo high flux além  de serem  mais permeáveis  do que as convencionais utilizam um maior volume  de dialisato , havendo considerável risco de passagem  de Endotoxina durante as diálises. Também há relatos  de que os dialisadores  do tipo high flux adsorvem mais Endotoxinas do que os convencionais ( 2 ). De modo interessante, já em 1987, Bommer e Ritz  chamavam atenção para a falta de qualidade do dialisato, relatando-o como “ problema negligenciado” ( 4 ).
 

2- PATOGÊNESE DA REAÇÃO PIROGÊNICA

Há pelo menos 3 linhas de evidência apontando Endotoxinas  como responsáveis por reação pirogênica  em Hemodiálise :

  1. a) Detectaram-se  anticorpos , nos pacientes em Hemodiálise , para Endotoxinas  elaboradas  por bactérias presentes no dialisato ( 5 , 6 );
  2. b) Comprovou-se reatividade ao teste do LAL  no plasma de pacientes em Hemodiálise com quadro clínico de Endotoxinemia ( 7 );
  3. c) Comprovou-se  a associação de reação pirogênica com dialisatos contaminados com bactérias  gram-negativas ( 8 ). Em função do diâmetro dos poros das membranas  de diálise , é pouco provável que microorganismos  ( bactérias , fungos , algas ) atravessem a membrana intacta e sim suas endotoxinas .

3- ENDOTOXINAS E SEUS FRAGMENTOS

As Endotoxinas  constituem o maior componente lipídico da membrana externa de bactérias gram-negativas, que liberam endotoxinas  no seu  meio circundante    durante a sua multiplicação e , mais ainda  quando morrem. Tanto as Endotoxinas como seus fragmentos são substâncias muito estáveis ; os processos usuais de  esterilização ( estufa e autoclave ) não são capazes de removê-las  de superfícies ou soluções. Para degradá-las  quimicamente devem ser usados ácidos ou bases fortes , ou um processo de pirólise ( 180 ° C por 3 horas , ou 250 ° C por 30 minutos )( 16 ) .

O seu peso molecular situa-se em torno  de 5000 daltons , mas suas características lipídicas e hidrofóbicas  permitem a formação de agregados  em soluções aquosas; o tamanho do agregado depende do tipo de solução , podendo atingir vários milhões de daltons , tornando-se particuladas .O peso molecular  também depende da estrutura química  que constitui uma determinada Endotoxina, da espécie de bactéria de que é oriunda , das condições do meio de crescimento da bactéria  e do método de sua extração( 18 ). Por sua  heterogeneidade  bioquímica , as Endotoxinas  adsorvem -se  de modo variado à maioria das superfícies , incluindo carvão ativado,resinas, vidros, plásticos e substratos de filtros.

As Endotoxinas ( pirogênios ) podem ser identificadas por testes  específicos , como o teste do LAL , o teste para  MNC (célula mononuclear ) e o teste para fragmentos de Lipopolissacarídios marcados por radiação. Existem identificadas pelo menos 6 substâncias bacterianas diferentes  capazes de gerar uma reação do tipo pirogênica( 9 ), como está mostrado no  Quadro I.

4- ATIVIDADE  BIOLÓGICA  E  GERAÇÃO DE INTERLEUCINA-1

A Endotoxina (ou  LPS ) , bem como os demais  fragmentos de bactérias  são capazes de induzir as células mononucleares humanas ( MNC ) a produzir  INTERLEUCINA-1 ( IL-1 ) e FATOR DE NECROSE TUMORAL ( TNF ) , que são duas citocinas integrantes  da resposta imune (10 ). Dentre os  múltiplos efeitos biológicos da IL-1 destacam-se a febre  (ação no hipotálamo), a neutrofilia (ação na medula óssea ), a proliferação de colágeno(estímulo de fibroblastos ), a liberação de aminoácidos de músculos , a produção de IL-2  ( ação nas células T ), e a produção de anticorpos ( ação nas células B ) ( 11 ).   As   Endotoxinas  interagem com vários sistemas  celulares e humorais . Após penetrar na circulação , ligam-se a lipoproteínas plasmáticas , resultando em redução de sua atividade biológica . Mesmo assim ativam o complemento , induzem a coagulação , afetam a função hepática e o sistema neuro-endócrino . Esta diversidade de respostas  fisiológicas  é direcionada à eliminação de Endotoxinas  , seus fragmentos , e até mesmo bactérias gram-negativas , e a seguir promover o reparo das lesões teciduais. Porém , devido a altas concentrações ou maior sensibilidade a Endotoxinas , as ações dos sistemas de defesa  tornam-se incontroláveis  e, invés de contribuir  , muitas destas respostas acabam sendo deletérias ao paciente.

A resposta pirogênica é o mais conhecido , mas apenas um dos vários efeitos  produzidos  por Endotoxinas ; elas também induzem os macrófagos do Sistema Retículo Endotelial (SRE) a liberar fatores antagonistas a glicocorticóide , fatores insulina-like ,fatores coagulantes , que determinam piora do reuso e mesmo coagulação de capilares , prostaglandinas ,óxido nítrico (indutor de vasodilatação sistêmica e  hipotensão no choque endotóxico), superóxidos e enzimas lisossômicas .  Enfim , estas substâncias introduzidas  iatrogenicamente  na corrente circulatória de pacientes em Hemodiálise produzem tantos sintomas e afetam tantos sistemas  que tornam difícil caracterizar um diagnóstico preciso . Como ainda não há disponível em nosso meio a dosagem plasmática de Endotoxina , o quadro clínico exuberante é o mais forte indício de uma Endotoxinemia , restando buscar o agente etiológico na água , através do teste do LAL.
 
 

5- O TESTE DO LIMULUS AMOEBOCYTE LYSATE  ( LAL )

Representa uma maneira simples e objetiva de detectar a presença de Endotoxinas  em amostras de água usadas em Unidades de Hemodiálise , podendo ser executado na própria Unidade.  A medida  de atividade de Endotoxina é avaliada em Unidades de Endotoxina por ml, abreviada com a sigla EU / ml.  Uma outra medida padronizada  é nanograma /ml (ng/ml), que equivale a 10 -9   g de massa de Endotoxina  . Em termos de equivalência , 1 ng/ml correspondem a 5 UE /ml , sendo estes os limites máximos permitidos em água para uso em Hemodiálise.

Conforme recomendação da Association for the Advancement of Medical Instrumentation  ( AAMI ) (12 ) , o padrão mínimo de qualidade de água para Hemodiálise  deve corresponder ao descrito no Quadro II:

O princípio biológico do teste do LAL  decorre  da coagulação  do sangue observada em um caranguejo , denominado Limulus polyphemus , quando seu sangue entra em contato com bactérias gram-negativas. No distante ano de 1885 Howell descreveu esta coagulação do sangue , mas só  na década de 50 , que Bang , no Marine Biological Laboratory , em Massachusets , correlacionou  esta coagulação com a presença de bactérias gram-negativas( 13 ).

Bang e Levin , posteriormente , descobriram que a reação é enzimática e que as enzimas estão localizadas nos grânulos dos amebócitos do caranguejo. A coagulação é iniciada por uma Endotoxina ( LPS ) ,componente  estrutural da parede celular bacteriana( 14 ).

Sabe-se hoje que a reação produzindo a formação de um gel , típica de teste positivo , é uma reação em cascata de ativação de enzimas. A proteína de coagulação ( coagulogênio ) é clivada por uma enzima coagulante ativada : os produtos  insolúveis da clivagem se ligam por interação iônica para formar o gel , característico de positividade do teste  do LAL( 15 ).

Existem hoje 3  métodos  diferentes para execução do teste do LAL .  O mais simples e prático é denominado Teste do Coágulo , empregado neste estudo. Os outros métodos ( Turbidimétrico e Cromogênico ) além de serem  mais sofisticados , exigem equipamentos complexos , aumentando os custos de execução. Para os propósitos de detectar a presença de Endotoxina  na água  de Hemodiálise ,o teste do LAL , através da formação de um coágulo , tem se mostrado satisfatório , sendo usado de rotina em muitos países.

O teste do LAL , pela técnica do coágulo, fornece resultados binários , ou positivo ou negativo, conforme a formação de coágulo ou não , constituindo -se em um teste muito objetivo , apesar de não ser quantitativo. A reação no tubo de ensaio é essencialmente a mesma que ocorre na natureza quando um caranguejo  Limulus é injuriado.

6- MATERIAIS e MÉTODOS

A- MATERIAIS

       Para a execução do teste do LAL a matéria prima está  disponível comercialmente como um produto para  detecção de Endotoxina , denominado Pyrotell. Os materiais e equipamentos indispensáveis à execução do teste LAL estão listados abaixo :

1- Reagente do Limulus Amoebocyte Lysate ( LAL ) , Pyrotell, em tubos individuais , contendo 0,2 ml de LAL liofilizado , nas sensibilidades de 0,03 a 0,25 UE/ml , baseadas na Endotoxina Padrão de Referência USP.

2- LAL Reagent Water , água apirogenica usada como diluente das amostras  a serem testadas.

3- Endotoxina Padrão, controle utilizado para confirmar a sensibilidade do Pyrotell , para validar o produto e para preparar os controles de inibição.

4-Banho-maria não circulante.

5-Estantes  para apoiar e incubar os tubos de reação.

6-Pipetas de vidro específicas ou pipetadores automáticos com ponteiras.

7-Vortex , tipo mixer.

8-Tubos de ensaio de vidro , de 18X150 mm , apirogenicos , com capacidade adequada para fazer  as diluições da endotoxina padrão ou da amostra em teste.

9-Estufa de ar quente a 180º Celsius ou 250° Celsius , capaz de  despirogenisar a vidraria.

10-Controles Positivos e Negativos de Endotoxina .

11-Recipientes de vidros especiais , despirogenisados , para coleta de amostras.

          O reagente para o teste do LAL apresenta uma Sensibilidade  que corresponde à mais  baixa concentração de Endotoxina  capaz de determinar  a formação de um coágulo em condições padronizadas. A sensibilidade do lote  em UE /ml , está impressa  no rótulo do frasco.
 

Figura II : reagentes para execução do LAL teste.

B- PREPARO E COLETA DAS AMOSTRAS

1- As amostras a serem testadas devem ser coletadas assepticamente , em recipientes apirogenicos. Vidraria apirogenica reutilizável , estéril , é recomendável para minimizar a adsorção de endotoxina na superfície dos recipientes.

2- Os recipientes , selecionados aleatoriamente de um lote , podem ser lavados com um pequeno volume de LRW , e a água de lavagem  ser testada  como uma amostra para avaliar se o lote é aceitável.

3- O pH  da mistura de reação ( amostra adicionada ao Pyrotell ) deve estar entre 6 e 8, devendo ser ajustado o pH da amostra com HCl, NaOH ou tampão.

C- EXECUÇÃO DO TESTE

Em síntese, faz-se primeiro a diluição adequada da amostra de água a ser testada com água apirogenica, conforme a sensibilidade  com que se fizer o teste. A seguir, adiciona-se um volume pré-determinado  da amostra  já diluída em tubos de ensaio contendo Endotoxina. Espera-se solubilizar por 30 a 60 segundos. Na seqüência, o tubo é colocado em banho-maria, sem agitação, durante 1 hora.
Figura III :  coágulo branco no fundo de tubo de ensaio a 180 °  : teste positivo.

Para fazer a leitura do teste , basta remover o tubo e invertê-lo a 180 graus . O teste positivo é indicado por um firme coágulo branco que se forma no fundo do tubo ;este coágulo não se quebra mesmo com o tubo invertido , permanecendo aderido ao tubo. Já o teste negativo não determina formação de coágulo , ou este é friável.

D- CONTROLES

Os controles são necessários para garantir que um teste seja válido , sendo usados controles positivos e negativos.Em 2 tubos contendo Endotoxina   (controle positivo ) são adicionados água a ser testada e água apirogenica. Por outro lado , em 2 tubos de ensaio não contendo Endotoxina ( controles negativos ), em 1 é adicionada água a ser testada e no outro água apirogenica. Após a solubilização por 30 a 60 segundos , as amostras são colocadas em banho -maria, por 1 hora, junto com as amostras de água que estão sendo testadas.

PROTOCOLOS DE ESTUDO:

       Foram  realizadas dosagens de Endotoxina, pelo teste do LAL , em  3 estudos diferentes :

ESTUDO I

Determinação de Endotoxina  em vários pontos de 2 Unidades de Hemodiálise (  A e B ) , obtendo-se amostras  de água após Osmose Reversa, na  água de dialisato e  na  água das salas de reuso.

ESTUDO II

Determinação de Endotoxina na água , pré e pós- tratamento , de 10 Unidades  de Hemodiálise de Porto Alegre e Região Metropolitana , sendo  5 amostras oriundas de água tratada através Osmose Reversa e 5 através Deionização.

ESTUDO III

Monitorização longitudinal trimestral  de 5 Unidades de Hemodiálise  com Osmose Reversa , quanto à presença de Endotoxina na água , nas etapas pré e pós – Osmose  e no dialisato.

Como rotina, nos 3 estudos , sempre foram usados CONTROLES  POSITIVOS e CONTROLES NEGATIVOS, para validar  os testes do LAL.


RESULTADOS

ESTUDO I : Presença de Endotoxina com Osmose Reversa

ESTUDO II : Comparativo entre Osmose Reversa e Deionisação

ESTUDO III : Monitorização  trimestral em 5 Unidades
( Resultados em UE /ml ; abaixo de 5,0 UE / ml considera-se NEGATIVO)

CONCLUSÕES

O investimento inicial em equipamentos para implantação do teste do Limulus Amoebocyte Lysate ( LAL ) , e o tempo dispendido em estudo e treinamento para a execução dos testes , são facilmente compensáveis  pela satisfação e segurança  de se ter uma água  de elevado padrão , testada pela própria  equipe.

A avaliação através do teste do  LAL constitui  uma das etapas do processo de tratamento de água  para Hemodiálise, cuja eficiência  deve ser periodicamente  comprovada , através da dosagem de elementos químicos ( alumínio, cloro, fluor etc. ) e de contaminantes biológicos (bactérias , endotoxinas). Observou-se em 100 % das 5 Unidades de Hemodiálise, que utilizavam Deionisadora  para tratamento da água ,a presença de Endotoxinas  superando o limite máximo tolerável de 5,0 UE / ml .  Em contraponto , em 100 % das Unidades que dispunham de Osmose Reversa  os níveis de Endotoxinas  foram inferiores a 5,0 UE / ml , sendo considerados negativos.

Na Unidade que trocou Deionisação por Osmose Reversa , em janeiro de 1999 , observou-se normalização do nível de Endotoxinas na água de diálise , após a troca. A monitorização longitudinal ( trimestral ) do nível de Endotoxinas, ao longo de 15 meses , em 5 Unidades com Osmose Reversa , permitiu constatar uma repetição de resultados negativos , abaixo de 5,0 UE / ml , comprobatórios  da segurança  e qualidade deste tipo de tratamento .

A monitorização longitudinal com o teste do LAL também permite  acompanhar o desempenho das membranas de Osmose Reversa , cuja vida útil limitada em muito depende do pré-tratamento  da água. Assim , uma eventual ruptura ou diminuição da capacidade de remoção de Endotoxinas  por danos à membrana ( depósitos , dano químico , colonização bacteriana ) podem gerar  elevações críticas de Endotoxina na água que são detectáveis pelo teste do LAL , desde que realizado freqüentemente.

Também reações pirogênicas ( raras hoje em dia ), coagulação de capilares , ou súbita piora de reuso , sem outra  causa aparente , podem ser atribuídas a altos níveis de Endotoxina  na água , desde que o teste do LAL seja realizado e demonstre a contaminação.

Uma outra constatação do estudo foi a  presença de água de boa qualidade , conforme o  teste do LAL , nos diversos pontos de captação das Unidades ( salas de reuso , dialisatos ). Assim , não se comprovou contaminação no sistema de distribuição ( encanamentos ) , que são fontes potenciais de proliferação bacteriana pela formação de biofilms. A presença significativa de biofilm pode ser prevenida  com tratamento específico e também monitorada através do teste do LAL .

Este primeiro relato brasileiro de dosagem de Endotoxina  pelo teste do Limulus  Amoebocyte Lysate, realizado por seus técnicos nas próprias Unidades de Hemodiálise , também é registro de uma ação coletiva na busca de um melhor  padrão de atendimento.

A detecção de Endotoxina é ferramenta indispensável para uma Unidade de Hemodiálise avaliar , de fato , a qualidade  de seu trabalho; com o conhecimento que se dispõe hoje das múltiplas complicações  determinadas por Endotoxinas ,  (iatrogenias perfeitamente evitáveis) , a sua manutenção em níveis adequados , abaixo de 5,0 UE / ml , é indispensável  para o bem-estar e saúde do paciente em diálise, tanto a curto como longo prazo.
 
 

REFERÊNCIAS

1- Harding, G.B. , Klein E. , Pass, T. and Million C. Endotoxin and bacterial contamination of dialysis center water and dialysate: a cross sectional survey. The International Journal of Artificial Organs 1990;13: 39-43.

2-Favero , M. ,Arduino M.J. et al.: A prospective study of pirogenic reactions in Hemodialysis  patients  using bicarbonate dialysis fluids  filtered to remove bactteria and endotoxin . J. Am. Soc. Nephrol 1992 ;3 ( 4 ) : 1001-1007.

3-Man ,N. K.,Ciancioni ,C. and Faivre , J.M. : Dialysis  associated  adverse reactions with  high – flux membranes  and microbial  contamination  of liquid  bicarbonate concentrate. Contr. Nephrol. 1988;62: 24-34.

4-Bommer J. and Ritz, E. : Water quality – a neglected  problem in hemodialysis. Nephron 1987 ; 46: 1-6.

5-Gazenfield-Grazit E. , Eliabou H.E.: Endotoxin antibodies in patients on maintenance hemodialysis . Israel J. Med. Sci 1969; 5 : 1032-1035.

6-Jones D. M. , Tobin B. M. , Harlow G.R. : Antibody production in patients on regular hemodialysis  to organisms present in dialysate . Proc. Eur. Dial. Transpl. Assoc. 1972; 9 : 575-576.

7- Hindman S.H.,Favero M.S. et al. : Pyrogenic  reactions  during haemodialysis  caused by intramural endotoxin. Lancet 1975 ;ii  732-734.

8- Raij L. , Shapiro F.L. , Michael  F. : Endotoxinemia in febrile reactions  during  hemodialysis . Kidney Int. 1973; 4: 57-60.

9- – Lonnemann G. , Bingel M. , Floege J. , Koch K. M. , Dinarello , C. : Detection  of endotoxin-like interleukin-1-induting activity during in vitro dialysis. Kidney Int. 1988; 33 : 29-35.

10-Dinarello C A: Interlekin-1 and its biologically related cytokines .Adv. Immunol. 1989;44: 153-205.

11-Dinarello C A : The multiple biologic activities of IL-1 . N. Engl. J. Med. 1984 ,311 ( 22 ):1413 -1417.

12- Association for the Advancement  of Medical Instrumentation , American National Standards, Inc. AAMI Standard and Recomended Practices , vol 3 : Dialysis 1993 , Arlington.

13- Bang, F.B. : The toxic effect of a marine  bacterium on Limulus and the formation of blood clots. Biol. Bull. ( Woods Hole , MA ) 1953 ; 105:361-362.

14- Levin J. and Bang , F.B. : A description of cellular coagulation in the Limulus . Bull. Johns Hopkins Hosp.1964, 115: 337-345.

15-Prior, R. :The LAL test , in Clinical Applications of the Limulus Amoebocyte Lysate  Test , CRC Press, Boston , 1990, chapter 3 ,27-36.

16- Gould MJ . Performing the LAL Gel-Clot Test in Facilities . Nephrology News&Issues 1988 ; (2) ,11 : 26-29.

17- Arduino MJ , Favero MS . Microbiologic Aspects of Hemodialysis .In : Water Quality for Dialysis . Association for the Advancement of Medical Instrumentation ( AAMI ) 1998 : 23-29.

18- Ismail N , Becker NB and Hakim R : Water Treatment for Hemodialysis .Am. J. Nephrol. 1966 ; 16: 60-72.

Rolar para cima