DETECÇÃO DE ENDOTOXINA PELO TESTE DO
Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) EM UNIDADES DE HEMODIÁLISE
FERNANDO DOS SANTOS(1), ANA G. SANTOS(1), JOÃO CARLOS BIERNAT(1), MARIA ELAINE L. SOUZA(1), ÁUREA RAUBACH(1), ALÉXIA AGUIRRE(1), VERA R. ANTONIAZZI(1), KEILA SCORSATTO(1), IVAN SEIBEL(1), SALETE S. DEMIN(2), ANE C. HICKMANN(2), FERNANDA P. OLIVEIRA(2), EWELIN V. BORBA(2), , SANDRA SIMON(2), SCHIRLE S. SANTOS(2). (*)
(*) Trabalho elaborado nas seguintes clínicas de Porto Alegre (RG): Clinirim, Prontorim Cachoeirinha, Nefrobelém, Clínica Nefrológica Guaíba, Suneva.
(1) médicos; (2) enfermeiras.
“ Aqua torbido non lava ” – provérbio italiano
1- INTRODUÇÃO
A água usada em Hemodiálise pode ser origem de Endotoxinas ( ou Lipopolissacarídios ) que causam várias respostas fisiológicas agudas , como febre , calafrios , cefaléia , mal-estar , mialgias , náuseas , bocejos , coagulação de dialisador , mas também podem determinar complicações a longo prazo , como caquexia e amiloidose , além de contribuir para sub-diálise.
Existe uma boa correlação entre a concentração de Endotoxinas e bactérias no dialisato e a presença de sintomas típicos de reação pirogênica (endotoxinemia) ( 1 ). Uma concentração bacteriana acima de 2000 colonias / ml , em geral , determina nível de Endotoxina suficiente para gerar sintomas clínicos ; em altas concentrações a Endotoxina atravessa a membrana do dialisador que apresente mínimas rupturas ou até mesmo membranas intactas , determinando sintomas (2).Altas concentrações de Endotoxinas no sangue ou líquido cérebro-espinal podem ser fatais , devido às graves complicações que se desenvolvem ( 16 ).
Também a água utilizada no reuso de dialisadores pode ser fonte de contaminação por Endotoxina , que por adsorção adere às paredes internas das fibras capilares, por onde circula o sangue . Assim , mesmo com o uso de substancias bactericidas na solução de reuso , a Endotoxina pode permanecer aderida à membrana de diálise e ser liberada para o sangue , durante a próxima sessão ( 3 ).
Mesmo em água esterilizada podem ser encontradas altas concentrações de Endotoxinas , enquanto que uma baixa contagem de colonias bacterianas não significa ausência de Endotoxinas. As bactérias mais frequentemente encontradas em água de Hemodiálise são gram-negativas , em torno de 90 % , com franco predomínio do gênero Pseudomonas. Bactérias gram-negativas podem se multiplicar muito rapidamente , mesmo em água esterilizada , alcançando altas concentrações ( > 100.000 col/ml ) em menos de 48 horas. Em soluções de diálise este crescimento bacteriano pode ser mais rápido , pela presença de glicose e bicarbonato , gerando altos níveis de Endotoxinas (3 , 17 ) , como se observa na figura 1.
Figura I : Multiplicação bacteriana e produção de endotoxina, em concentrado de bicarbonato, a 30 ° C.
As membranas do tipo high flux além de serem mais permeáveis do que as convencionais utilizam um maior volume de dialisato , havendo considerável risco de passagem de Endotoxina durante as diálises. Também há relatos de que os dialisadores do tipo high flux adsorvem mais Endotoxinas do que os convencionais ( 2 ). De modo interessante, já em 1987, Bommer e Ritz chamavam atenção para a falta de qualidade do dialisato, relatando-o como “ problema negligenciado” ( 4 ).
2- PATOGÊNESE DA REAÇÃO PIROGÊNICA
Há pelo menos 3 linhas de evidência apontando Endotoxinas como responsáveis por reação pirogênica em Hemodiálise :
3- ENDOTOXINAS E SEUS FRAGMENTOS
As Endotoxinas constituem o maior componente lipídico da membrana externa de bactérias gram-negativas, que liberam endotoxinas no seu meio circundante durante a sua multiplicação e , mais ainda quando morrem. Tanto as Endotoxinas como seus fragmentos são substâncias muito estáveis ; os processos usuais de esterilização ( estufa e autoclave ) não são capazes de removê-las de superfícies ou soluções. Para degradá-las quimicamente devem ser usados ácidos ou bases fortes , ou um processo de pirólise ( 180 ° C por 3 horas , ou 250 ° C por 30 minutos )( 16 ) .
O seu peso molecular situa-se em torno de 5000 daltons , mas suas características lipídicas e hidrofóbicas permitem a formação de agregados em soluções aquosas; o tamanho do agregado depende do tipo de solução , podendo atingir vários milhões de daltons , tornando-se particuladas .O peso molecular também depende da estrutura química que constitui uma determinada Endotoxina, da espécie de bactéria de que é oriunda , das condições do meio de crescimento da bactéria e do método de sua extração( 18 ). Por sua heterogeneidade bioquímica , as Endotoxinas adsorvem -se de modo variado à maioria das superfícies , incluindo carvão ativado,resinas, vidros, plásticos e substratos de filtros.
As Endotoxinas ( pirogênios ) podem ser identificadas por testes específicos , como o teste do LAL , o teste para MNC (célula mononuclear ) e o teste para fragmentos de Lipopolissacarídios marcados por radiação. Existem identificadas pelo menos 6 substâncias bacterianas diferentes capazes de gerar uma reação do tipo pirogênica( 9 ), como está mostrado no Quadro I.
4- ATIVIDADE BIOLÓGICA E GERAÇÃO DE INTERLEUCINA-1
A Endotoxina (ou LPS ) , bem como os demais fragmentos de bactérias são capazes de induzir as células mononucleares humanas ( MNC ) a produzir INTERLEUCINA-1 ( IL-1 ) e FATOR DE NECROSE TUMORAL ( TNF ) , que são duas citocinas integrantes da resposta imune (10 ). Dentre os múltiplos efeitos biológicos da IL-1 destacam-se a febre (ação no hipotálamo), a neutrofilia (ação na medula óssea ), a proliferação de colágeno(estímulo de fibroblastos ), a liberação de aminoácidos de músculos , a produção de IL-2 ( ação nas células T ), e a produção de anticorpos ( ação nas células B ) ( 11 ). As Endotoxinas interagem com vários sistemas celulares e humorais . Após penetrar na circulação , ligam-se a lipoproteínas plasmáticas , resultando em redução de sua atividade biológica . Mesmo assim ativam o complemento , induzem a coagulação , afetam a função hepática e o sistema neuro-endócrino . Esta diversidade de respostas fisiológicas é direcionada à eliminação de Endotoxinas , seus fragmentos , e até mesmo bactérias gram-negativas , e a seguir promover o reparo das lesões teciduais. Porém , devido a altas concentrações ou maior sensibilidade a Endotoxinas , as ações dos sistemas de defesa tornam-se incontroláveis e, invés de contribuir , muitas destas respostas acabam sendo deletérias ao paciente.
A resposta pirogênica é o mais conhecido , mas apenas um dos vários efeitos produzidos por Endotoxinas ; elas também induzem os macrófagos do Sistema Retículo Endotelial (SRE) a liberar fatores antagonistas a glicocorticóide , fatores insulina-like ,fatores coagulantes , que determinam piora do reuso e mesmo coagulação de capilares , prostaglandinas ,óxido nítrico (indutor de vasodilatação sistêmica e hipotensão no choque endotóxico), superóxidos e enzimas lisossômicas . Enfim , estas substâncias introduzidas iatrogenicamente na corrente circulatória de pacientes em Hemodiálise produzem tantos sintomas e afetam tantos sistemas que tornam difícil caracterizar um diagnóstico preciso . Como ainda não há disponível em nosso meio a dosagem plasmática de Endotoxina , o quadro clínico exuberante é o mais forte indício de uma Endotoxinemia , restando buscar o agente etiológico na água , através do teste do LAL.
5- O TESTE DO LIMULUS AMOEBOCYTE LYSATE ( LAL )
Representa uma maneira simples e objetiva de detectar a presença de Endotoxinas em amostras de água usadas em Unidades de Hemodiálise , podendo ser executado na própria Unidade. A medida de atividade de Endotoxina é avaliada em Unidades de Endotoxina por ml, abreviada com a sigla EU / ml. Uma outra medida padronizada é nanograma /ml (ng/ml), que equivale a 10 -9 g de massa de Endotoxina . Em termos de equivalência , 1 ng/ml correspondem a 5 UE /ml , sendo estes os limites máximos permitidos em água para uso em Hemodiálise.
Conforme recomendação da Association for the Advancement of Medical Instrumentation ( AAMI ) (12 ) , o padrão mínimo de qualidade de água para Hemodiálise deve corresponder ao descrito no Quadro II:
O princípio biológico do teste do LAL decorre da coagulação do sangue observada em um caranguejo , denominado Limulus polyphemus , quando seu sangue entra em contato com bactérias gram-negativas. No distante ano de 1885 Howell descreveu esta coagulação do sangue , mas só na década de 50 , que Bang , no Marine Biological Laboratory , em Massachusets , correlacionou esta coagulação com a presença de bactérias gram-negativas( 13 ).
Bang e Levin , posteriormente , descobriram que a reação é enzimática e que as enzimas estão localizadas nos grânulos dos amebócitos do caranguejo. A coagulação é iniciada por uma Endotoxina ( LPS ) ,componente estrutural da parede celular bacteriana( 14 ).
Sabe-se hoje que a reação produzindo a formação de um gel , típica de teste positivo , é uma reação em cascata de ativação de enzimas. A proteína de coagulação ( coagulogênio ) é clivada por uma enzima coagulante ativada : os produtos insolúveis da clivagem se ligam por interação iônica para formar o gel , característico de positividade do teste do LAL( 15 ).
Existem hoje 3 métodos diferentes para execução do teste do LAL . O mais simples e prático é denominado Teste do Coágulo , empregado neste estudo. Os outros métodos ( Turbidimétrico e Cromogênico ) além de serem mais sofisticados , exigem equipamentos complexos , aumentando os custos de execução. Para os propósitos de detectar a presença de Endotoxina na água de Hemodiálise ,o teste do LAL , através da formação de um coágulo , tem se mostrado satisfatório , sendo usado de rotina em muitos países.
O teste do LAL , pela técnica do coágulo, fornece resultados binários , ou positivo ou negativo, conforme a formação de coágulo ou não , constituindo -se em um teste muito objetivo , apesar de não ser quantitativo. A reação no tubo de ensaio é essencialmente a mesma que ocorre na natureza quando um caranguejo Limulus é injuriado.
6- MATERIAIS e MÉTODOS
A- MATERIAIS
Para a execução do teste do LAL a matéria prima está disponível comercialmente como um produto para detecção de Endotoxina , denominado Pyrotell. Os materiais e equipamentos indispensáveis à execução do teste LAL estão listados abaixo :
1- Reagente do Limulus Amoebocyte Lysate ( LAL ) , Pyrotell, em tubos individuais , contendo 0,2 ml de LAL liofilizado , nas sensibilidades de 0,03 a 0,25 UE/ml , baseadas na Endotoxina Padrão de Referência USP.
2- LAL Reagent Water , água apirogenica usada como diluente das amostras a serem testadas.
3- Endotoxina Padrão, controle utilizado para confirmar a sensibilidade do Pyrotell , para validar o produto e para preparar os controles de inibição.
4-Banho-maria não circulante.
5-Estantes para apoiar e incubar os tubos de reação.
6-Pipetas de vidro específicas ou pipetadores automáticos com ponteiras.
7-Vortex , tipo mixer.
8-Tubos de ensaio de vidro , de 18X150 mm , apirogenicos , com capacidade adequada para fazer as diluições da endotoxina padrão ou da amostra em teste.
9-Estufa de ar quente a 180º Celsius ou 250° Celsius , capaz de despirogenisar a vidraria.
10-Controles Positivos e Negativos de Endotoxina .
11-Recipientes de vidros especiais , despirogenisados , para coleta de amostras.
O reagente para o teste do LAL apresenta uma Sensibilidade que corresponde à mais baixa concentração de Endotoxina capaz de determinar a formação de um coágulo em condições padronizadas. A sensibilidade do lote em UE /ml , está impressa no rótulo do frasco.
Figura II : reagentes para execução do LAL teste.
B- PREPARO E COLETA DAS AMOSTRAS
1- As amostras a serem testadas devem ser coletadas assepticamente , em recipientes apirogenicos. Vidraria apirogenica reutilizável , estéril , é recomendável para minimizar a adsorção de endotoxina na superfície dos recipientes.
2- Os recipientes , selecionados aleatoriamente de um lote , podem ser lavados com um pequeno volume de LRW , e a água de lavagem ser testada como uma amostra para avaliar se o lote é aceitável.
3- O pH da mistura de reação ( amostra adicionada ao Pyrotell ) deve estar entre 6 e 8, devendo ser ajustado o pH da amostra com HCl, NaOH ou tampão.
C- EXECUÇÃO DO TESTE
Em síntese, faz-se primeiro a diluição adequada da amostra de água a ser testada com água apirogenica, conforme a sensibilidade com que se fizer o teste. A seguir, adiciona-se um volume pré-determinado da amostra já diluída em tubos de ensaio contendo Endotoxina. Espera-se solubilizar por 30 a 60 segundos. Na seqüência, o tubo é colocado em banho-maria, sem agitação, durante 1 hora.
Figura III : coágulo branco no fundo de tubo de ensaio a 180 ° : teste positivo.
Para fazer a leitura do teste , basta remover o tubo e invertê-lo a 180 graus . O teste positivo é indicado por um firme coágulo branco que se forma no fundo do tubo ;este coágulo não se quebra mesmo com o tubo invertido , permanecendo aderido ao tubo. Já o teste negativo não determina formação de coágulo , ou este é friável.
D- CONTROLES
Os controles são necessários para garantir que um teste seja válido , sendo usados controles positivos e negativos.Em 2 tubos contendo Endotoxina (controle positivo ) são adicionados água a ser testada e água apirogenica. Por outro lado , em 2 tubos de ensaio não contendo Endotoxina ( controles negativos ), em 1 é adicionada água a ser testada e no outro água apirogenica. Após a solubilização por 30 a 60 segundos , as amostras são colocadas em banho -maria, por 1 hora, junto com as amostras de água que estão sendo testadas.
PROTOCOLOS DE ESTUDO:
Foram realizadas dosagens de Endotoxina, pelo teste do LAL , em 3 estudos diferentes :
ESTUDO I
Determinação de Endotoxina em vários pontos de 2 Unidades de Hemodiálise ( A e B ) , obtendo-se amostras de água após Osmose Reversa, na água de dialisato e na água das salas de reuso.
ESTUDO II
Determinação de Endotoxina na água , pré e pós- tratamento , de 10 Unidades de Hemodiálise de Porto Alegre e Região Metropolitana , sendo 5 amostras oriundas de água tratada através Osmose Reversa e 5 através Deionização.
ESTUDO III
Monitorização longitudinal trimestral de 5 Unidades de Hemodiálise com Osmose Reversa , quanto à presença de Endotoxina na água , nas etapas pré e pós – Osmose e no dialisato.
Como rotina, nos 3 estudos , sempre foram usados CONTROLES POSITIVOS e CONTROLES NEGATIVOS, para validar os testes do LAL.
RESULTADOS
ESTUDO I : Presença de Endotoxina com Osmose Reversa
ESTUDO II : Comparativo entre Osmose Reversa e Deionisação
ESTUDO III : Monitorização trimestral em 5 Unidades
( Resultados em UE /ml ; abaixo de 5,0 UE / ml considera-se NEGATIVO)
CONCLUSÕES
O investimento inicial em equipamentos para implantação do teste do Limulus Amoebocyte Lysate ( LAL ) , e o tempo dispendido em estudo e treinamento para a execução dos testes , são facilmente compensáveis pela satisfação e segurança de se ter uma água de elevado padrão , testada pela própria equipe.
A avaliação através do teste do LAL constitui uma das etapas do processo de tratamento de água para Hemodiálise, cuja eficiência deve ser periodicamente comprovada , através da dosagem de elementos químicos ( alumínio, cloro, fluor etc. ) e de contaminantes biológicos (bactérias , endotoxinas). Observou-se em 100 % das 5 Unidades de Hemodiálise, que utilizavam Deionisadora para tratamento da água ,a presença de Endotoxinas superando o limite máximo tolerável de 5,0 UE / ml . Em contraponto , em 100 % das Unidades que dispunham de Osmose Reversa os níveis de Endotoxinas foram inferiores a 5,0 UE / ml , sendo considerados negativos.
Na Unidade que trocou Deionisação por Osmose Reversa , em janeiro de 1999 , observou-se normalização do nível de Endotoxinas na água de diálise , após a troca. A monitorização longitudinal ( trimestral ) do nível de Endotoxinas, ao longo de 15 meses , em 5 Unidades com Osmose Reversa , permitiu constatar uma repetição de resultados negativos , abaixo de 5,0 UE / ml , comprobatórios da segurança e qualidade deste tipo de tratamento .
A monitorização longitudinal com o teste do LAL também permite acompanhar o desempenho das membranas de Osmose Reversa , cuja vida útil limitada em muito depende do pré-tratamento da água. Assim , uma eventual ruptura ou diminuição da capacidade de remoção de Endotoxinas por danos à membrana ( depósitos , dano químico , colonização bacteriana ) podem gerar elevações críticas de Endotoxina na água que são detectáveis pelo teste do LAL , desde que realizado freqüentemente.
Também reações pirogênicas ( raras hoje em dia ), coagulação de capilares , ou súbita piora de reuso , sem outra causa aparente , podem ser atribuídas a altos níveis de Endotoxina na água , desde que o teste do LAL seja realizado e demonstre a contaminação.
Uma outra constatação do estudo foi a presença de água de boa qualidade , conforme o teste do LAL , nos diversos pontos de captação das Unidades ( salas de reuso , dialisatos ). Assim , não se comprovou contaminação no sistema de distribuição ( encanamentos ) , que são fontes potenciais de proliferação bacteriana pela formação de biofilms. A presença significativa de biofilm pode ser prevenida com tratamento específico e também monitorada através do teste do LAL .
Este primeiro relato brasileiro de dosagem de Endotoxina pelo teste do Limulus Amoebocyte Lysate, realizado por seus técnicos nas próprias Unidades de Hemodiálise , também é registro de uma ação coletiva na busca de um melhor padrão de atendimento.
A detecção de Endotoxina é ferramenta indispensável para uma Unidade de Hemodiálise avaliar , de fato , a qualidade de seu trabalho; com o conhecimento que se dispõe hoje das múltiplas complicações determinadas por Endotoxinas , (iatrogenias perfeitamente evitáveis) , a sua manutenção em níveis adequados , abaixo de 5,0 UE / ml , é indispensável para o bem-estar e saúde do paciente em diálise, tanto a curto como longo prazo.
REFERÊNCIAS
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